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淋巴細胞的保存和活力測定

一、分離細胞的保存

在某些情況下，分離所得細胞需要加以保存，否則活力迅速下降，甚至死亡。

(一)短期保存技術(shù)

將 分離到的細胞用適量含10%～20%滅活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培養(yǎng)液稀釋重懸。所用培養(yǎng)液要求等滲，具緩沖作用， 并對細胞無毒性。通常置4℃保存較好，可減低細胞代謝活動。要注意不要迅速改變細胞所處的溫度，以免造成細胞“溫度”休克。

(二)長期冷凍保存技術(shù)

利 用液氮深低溫(-196℃)環(huán)境保存細胞，是當前世界上通用的細胞長期保存技術(shù)。其原理在于深低溫環(huán)境可中斷細胞的代謝，但在降溫過程由于冰晶的形成和滲 透壓的改變均可導致細胞的損傷和部分死亡，所以在冷凍過程中一定要加用冷凍保護劑，常用的保護劑為二甲亞砜 (dimethylsulfoxide，DMSO)。冷凍時的降溫速度和細胞解凍時的升溫速度對細胞活力的保存有很大影響。條件合適時，凍存細胞一旦復 蘇，恢復37℃培養(yǎng)，其形態(tài)和代謝活動均可恢復正常。操作的原則是先對需凍存的細胞作活細胞計數(shù)，低速離心后，取沉積細胞用含10%二甲亞砜的小牛血清配 制成適當濃度的細胞懸液，分裝于凍存管內(nèi)，速即放入降溫過渡站中，避免二甲亞砜對細胞的損傷。繼而進行降溫冷凍，目前常用兩步降溫法，即迅速降溫至一選擇 好的臨界溫作為過渡站，如-80℃低溫冰箱過夜，或在液氮罐液面以上的一層空間放置片刻，然后再放入液氮中。如需復蘇細胞，則需迅速解凍以恢復細胞的活 力，要求在20s以內(nèi)完全融化。將凍存管自液氮中取出，立即放入40℃溫水中，融化后即從水中取出，吸出細胞懸液，加入10倍的培養(yǎng)液中混勻，繼而低速離 心，盡快洗去保護劑，再懸于新培養(yǎng)液中，計數(shù)并檢查細胞活力，然后置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

二、細胞活力測定

細胞活力常用百分 比表示，活力的大小對試驗結(jié)果有很大影響。細胞活力的測定有許多方法，最簡便常用的方法是臺盼藍(trypanblue)染色法。臺盼藍又稱錐藍，是一種 陰離子型染料，這種染料不能透過活細胞正常完整的細胞膜，故活細胞不著色，但死亡細胞的細胞膜通透性增加，可使染料通過細胞膜進入細胞內(nèi)，使死細胞著色呈 藍色。

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